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| DNA鑒定之SNP分型方法的四種基本原理 |
1．雜交：在雜交法中，針對SNP位點及側翼序列設計探針，通常探針間只有一個堿基的差異，分別對應于不同的等位基因。在優化的反應（雜交、洗脫等）條件下，單堿基錯配足以破壞雜交體的形成，防止靶序列與錯誤的等位基因探針結合使其僅在序列完全匹配的情況下雜交。因為在分型反應中不摻入酶，雜交是最簡單的機理。確保區分的難點在于探針設計。采用先進的探針設計方法和雜交增強分子，如DNA水溝結合分子(minor groove binding molecule)，可提高探針設計的成功率。 2．引物延伸：引物延伸反應的特異性表現在兩個方面：①DNA聚合酶摻入與模板互補堿基的高度特異性（如測序）；②DNA聚合酶引發延伸反應時要求PCR引物的3′端與靶DNA序列完全互補的嚴格性(如等位基因特異性PCR)。引物延伸法在應用中靈活性高，具有大量變化形式，所需引物和探針數目較少，并且探針設計和優化較為簡便。 3．連接：DNA連接酶在修復DNA分子缺刻時具有高度的序列特異性。兩條相鄰的寡核苷酸與模板退火，僅當其在接合處與模板完全匹配時才會在連接酶的作用下連接在一起，因而等位基因特異性寡核苷酸能夠探查多態性位點堿基的性質。盡管連接反應在所有等位基因區分機理中最具特異性且最易優化，但它的反應速度最慢且需要大量的修飾探針。 4．侵入切割：針對特定結構的切割酶能夠切割部分重疊的寡核苷酸探針雜交形成的復合物。侵入切割(invasive cleavage)反應中需要使用兩條分別對應于野生型和突變型的寡核苷酸探針和一條位于上游的侵入探針。設計探針時將多態性位點置于重疊處，正確的重疊結構僅在侵入探針和完全匹配的等位基因特異性探針間形成，而非單堿基錯配的探針。切割產物用于產生信號的次級反應中。此信號放大步驟幫助捉高標記切割產物的量不經靶序列擴增即可實現檢測。此方法的優點在于等溫反應和無需PCR擴增即可分型，但尚存一些技術問題有待解決：①反應需大量基因組DNA;②需要高純度的特異性探針才可忽略非特異性反應；③因為在相同條件下連續反應，而且SNP序列固定，所以探針設計較復雜。更多詳情：http://www.qinzijianding.cn |
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